先要配制孢子形成培養(yǎng)基。孢子形成培養(yǎng)基時(shí)由硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸美、氯化鉀及硫酸亞鐵及糖類的全部或一部分配制的，PH為4～7，優(yōu)選為5～6.5。在此配制培養(yǎng)基中加入瓊脂，經(jīng)加熱滅菌后冷卻凝固，把其產(chǎn)物作為孢子形成培養(yǎng)基。只要能使菌絲增殖和孢子形成，對(duì)孢子形成培養(yǎng)基無(wú)特別要求，其特征為把PH調(diào)至適合孢子形成的4～7范圍內(nèi)。
具體舉例，如在Czapek瓊脂培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸美·7結(jié)晶水0.5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸亞鐵·7結(jié)晶水0.01g/L、蔗糖30g/L、瓊脂13g/L)中加入鹽酸或硫酸，將PH調(diào)至6.0的培養(yǎng)基。再舉一例，如在Czapek-Dox瓊脂培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/L、磷酸氫二鉀1g/L、硫酸美·7結(jié)晶水0.5g/L、氯化鉀0.5g/L、硫酸亞鐵·7結(jié)晶水0.01g/L、葡萄糖30g/L、瓊脂13g/L)中加入鹽酸或硫酸，將PH調(diào)至6.0的培養(yǎng)基。
用此方法在試管內(nèi)制成斜面培養(yǎng)基(Slant培養(yǎng)基)或在培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板培養(yǎng)基(Plate培養(yǎng)基)，在此培養(yǎng)基上接種菌絲或孢子，在好氣條件下進(jìn)行固體培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度保持在0～40℃，優(yōu)選10～35℃，更優(yōu)選在15～30℃使其增殖和孢子形成。培養(yǎng)溫度可在中途改變，例如可使其在25℃條件下增殖后，在5℃條件下培養(yǎng)。
確認(rèn)孢子形成后，在固體培養(yǎng)菌絲中添加滅菌水，用常用方法攪拌獲得孢子懸浮液。添加于滅菌水中的添加物無(wú)特別要求，可為純水，亦可添加表面活性劑、無(wú)機(jī)鹽類等，還可使用預(yù)先調(diào)制的生理鹽水。攪拌方法可從外部給固體培養(yǎng)容器加力，亦可使用預(yù)先滅菌的刷子等直接攪拌菌絲。
將上述得到的孢子懸浮液或?qū)㈡咦雍途z的懸浮液作為保藏原液。此保藏原液可用滅菌水或表面活性劑或含有無(wú)機(jī)鹽類的水溶液稀釋后再重新作為保藏原液。之后在此保藏原液中添加冷凍保護(hù)劑。對(duì)冷凍保護(hù)劑的使用一般無(wú)特別要求，可從瓊脂粉、牛血清、DMSO、甘油、肌醇、聚乙烯醇、脫脂牛奶等中選一種或多種添加。具體舉例，如為使保藏液中甘油濃度達(dá)到10％，可把甘油作為冷凍保護(hù)劑添加。
添加冷凍保護(hù)劑后，將保藏液分裝在保藏容器中。容器宜使用滅菌塑料凍存管等，具體舉例，如把保藏液在無(wú)菌操作條件下分裝于容量1.2mL的凍存管中等。之后將此保藏容器置于超低溫冰箱內(nèi)保藏。超低溫冰箱內(nèi)的溫度需控制在-100℃～-20℃范圍內(nèi)，優(yōu)選在-90℃～-30℃，更優(yōu)選在-85℃～-50℃。
由此，在超低溫冰箱內(nèi)保藏的菌株可長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定地保藏。 |
